SELECCION DE UN FLUOROCROMO

-Su expectro de absorción debe ser lo mas cercano posible al espectro de emisión del láser utilizado.
-La probabilidad que posee para absorber luz debe de ser alto. En unos fluorocromos es mayor que en otros, como por ejemplo el PE tiene mayor probabilidad que el FITC.
-La probabilidad de emitir fotones (rendimiento cuántico) en el momento de absorber luz debe de ser alto. En el PE también es mayor que en FITC.
-El espectro de emisión debe ser diferente al de emisión para asegurar que ambas señales se separan.
-El tamaño del conjugado puede hacer insoluble el complejo AcMo/fluorocromo. Esto puede ocurrir sobre todo con el PE.
-Hay que tener en cuenta el número de moléculas unidas al anticuerpo, ya que si aumenta, también aumenta la fluorescencia, produciendo artefactación de la emisión por proximidad.
-Que posean un corto estado de excitación.
-Que seán fotoestables. (www.citometriadeflujo.com)

FLUOROCROMOS

   L os fluorocromos son moléculas químicas que absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten a otra diferente. Se caracterizan por sus espectros de excitación y de emisión, por lo que su utilización está condicionada por el tipo de láser del que disponga el citómetro y de la longitud de onda a la que se exciten ellos mismos. El espectro de excitación y emisión varia con los diferentes fluorocromos. Si disponemos de una láser con una longitud de onda de 488 nm los fluorocromos que utilizemos deberán ser capaces de ser excitados a esta longitud de onda y además emitir en longitudes lo mas lejanas posibles entre ellas. En CMF los Ac-Mo. están conjugados con fluorocromos siendo la intensidad de fluorescencia detectada por el citómetro directamente proporcional al número de moléculas unidas al Ag . La intensidad de fluorescencia también depende del fluorocromo utilizado, ya que hay fluorocromos que emiten con mayor intensidad que otros. En algunas ocasiones ciertos fluorocromos producen el llamado fenómeno Quenching referido como la transferencia de energía entre dos moléculas marcadas con el mismo fluorocromo, y que están suficientemente cercanas. Debido a ello una molécula puede ser excitada por la luz del láser y por la luz que emite la otra molécula. Los Fluorocromos mas utilizados son:
- FITC: Isocianato de fluoresceina. Se excita con luz azul a 490nm y emite a 514nm. Produce Quen-ching. Su rendimiento cuántico es 0.5.
- PE: Ficoeritrina. Se excita a 480nm pero no es su máximo (565nm) y emite a 578nm. No produce Quenching.
- PerCP: Proteína Clorofila Peridinina. Se excita a 488nm. y emite a
- TRITC: Isocianato de Tetrametil Rodamina se excita a 540nm y emite a 570nm.
- Ficoeritrina-Cianina 5.
- Rojo Texas: Se excita a 596nm y emite a 615nm.
- Ficocianina: Se excita a 620nm y emite a 650nm.
- Aloficocianina: Se excita a 650nm y emite a 660nm.
- Tricolor: Se excita a 540nm y emite a 570nm.
- APC: Utilizado como cuarto color en citometros de BD. Se excita a 635nm y emite a 670nm.
- Fluorocromos para marcar ácidos nucleicos son: Yoduro de Propidio que se excita a 493nm y emite a 630nm, Bromuro de Etidio, Naranja de Acridina que para marcar DNA se excita a 480nm y emite a 510nm y para RNA se excita a 440/470nm y emite a 650nm, Hoescht 33342 que se excita a 343nm y emite a 482nm, Naranja de Triazol que se excita a 509nm y emite a 533nm, Mitramicina, Cromomicina A3, y el DAPI que se excita a 345nm y emite a 455nm.

   En los fluorocromos combinados, un fluorocromo se excita con la luz de excitación, la luz que emite este es absorbida por el segundo fluorocromo cuya emisión de luz es la que se mide. Esto permite utilizar fluorocromos que se excitan a distinta longitud de onda de la que posee el láser. Por ejemplo, en la combinación PE-RT, el RT se excita a 596 nm y emite a 615 nm y la PE se excita a 480 nm y emite a 578nm. La luz azul (488 nm) excita la PE que emite luz naranja (578nm) y esta a su vez excita al RT y emite luz roja. (www.citometriadeflujo.com)