INMUNOFENOTIPO. GENERALIDADES.

   La citometría de flujo es una técnica que permite un análisis celular multiparamétrico de forma rápida, sensible y específica. La disponibilidad de amplios paneles de reactivos de gran calidad facilita la aplicación de este método analítico en el diagnóstico, clasificación, evaluación pronóstica, y valoración de enfermedad mínima residual. La citometría de flujo permite el análisis de un gran número de células (habitualmente entre 10,000 células por muestra, y más de un millón en los estudios de enfermedad mínima residual). La aplicación de la citometría de flujo al análisis celular permite conocer aspectos físicos de la célula (tamaño y complejidad) y determinar la presencia o ausencia de determinados antígenos (habitualmente entre 3 y 4) en los diferentes compartimentos celulares (superficie celular, citoplasma, mitocondria, núcleo) lo que contribuye a aumentar tanto la especifidad como la sensibilidad de la prueba. Esto ha determinado que en estos momentos la citometría de flujo sea una herramienta básica para el estudio de las hemopatías malignas. Su aplicación permite una correcta clasificación de la gran mayoría de las leucemias, el conocimiento de la hematopoyesis normal definiendo patrones fenotípicos de normalidad y fenotipos aberrantes leucémicos que permitirán dada la utilización de terapias cada vez más eficaces el seguimiento sensible de la respuesta al tratamiento y el diseño de esquemas terapéuticos en función de este seguimiento (detección de enfermedad residual mínima), la detección de células raras o células presentes en un porcentaje muy bajo (mastocitos, células dendríticas), el análisis de genes supresores de tumores (p53), el estudio del ciclo celular y de las proteínas relacionadas con el mismo (ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas), y el estudio de apoptosis (cuantificación de células en apoptosis -Apo 2.7, anexina-V-, proteínas relacionadas con apoptosis -bcl-2, bax, Mcl-1, bcl-xs, bcl-xl, survivina-, caspasas). La utilización de triples y cuádruples marcajes antigénicos (combinación de anticuerpos monoclonales conjugados con diferentes fluorocromos) nos permite que todo lo anteriormente expuesto sea analizado en las células que específicamente queremos analizar sin necesidad de utilizar métodos de separación celular que conllevan un consumo de tiempo y una sobrecarga de trabajo en el laboratorio y que en ocasiones dan lugar a la pérdida de células de interés. Estos procedimientos directos, sin separación celular, permiten una cuantificación adecuada de las poblaciones presentes en la muestra, y minimizan las posibles modificaciones en la expresión antigénica. (www.citometriadeflujo.com)

   Desde un punto de vista diagnóstico, su utilización permite como dijimos anteriormente una correcta clasificación de la neoplasia en más del 90% de los casos. Para ello nos basamos en el concepto de definición de línea celular utilizando anticuerpos monoclonales dirigidos frente a antígenos específicos de línea: CD79a citoplásmico y CD19 para la definición de línea linfoide B; CD3 citoplásmico para la definición de línea linfoide T y Mieloperoxidasa (MPO) para la definición de línea mieloide. La utilización posterior de una batería más amplia de anticuerpos monoclonales permite establecer una subclasificación de las leucemias en ocasiones con implicaciones terapéuticas (M3, LAL línea B madura).(www.citometriadeflujo.com)

   La aplicación de la citometría de flujo en el estudio de las neoplasias hematológicas es una práctica médica ampliamente aceptada. Su utilidad tiene claras implicaciones diagnósticas y de clasificación de las neoplasias, en determinados casos pronósticas y nos permite un seguimiento más sensible de estas neoplasias hematológicas. Igualmente podemos detectar subpoblaciones leucémicas resistentes in vitro a fármacos, y finalmente podemos aproximar determinadas alteraciones moleculares en función de la presencia o ausencia de determinados antígenos, algunos de ellos proteínas quiméricas resultantes de la fusión de determinados genes. (www.citometriadeflujo.com)

   El estudio de la expresión de cadenas ligeras (Kappa y Lambda) en los linfocitos B permite definir patrones de clonalidad. En condiciones normales los linfocitos B maduros de los órganos linfoides expresan de forma excluyente cadena ligera Kappa y cadena ligera Lambda con una relación próxima a 2/1. El conocimiento de esta relación ha permitido definir conceptos como: 1) expansión B policlonal con una relación Kappa/Lambda adecuada como ocurre en las mujeres fumadoras HLA-Dr7+ y con una configuración policlonal del gen que codifica la cadena pesada de la inmunoglobulina; 2) expansión B con restricción de cadena ligera Kappa o Lambda, como ocurre en los síndromes linfoproliferativos crónicos B. En citometría de flujo se define la restricción de cadena ligera Kappa cuando la relación Kappa/Lambda es igual o superior de 10/1, o restricción de cadena ligera Lambda cuando la relación Lambda/Kappa es superior de 3/1. Los linfocitos B maduros por definición expresan cadena ligera, kappa o lambda, y por tanto también se considera patológico la ausencia de cadena ligera en linfocitos B circulantes o presentes en los órganos linfoides secundarios. En el estudio inmunofenotípico de médula ósea sí es habitual y normal encontrar células de línea B que no expresan cadenas ligeras (progenitores linfoides B, CD10+ en diferente grado de intensidad). (www.citometriadeflujo.com)

   Por último también es posible mediante citometría de flujo valorar la intensidad de expresión de la cadena ligera, definiendo patrones de intensidad característicos en ocasiones de determinadas patologías como la LLC-B con una expresión débil de cadena ligera. En el estudio de la patología T, el estudio del repertorio TCR mediante anticuerpos monoclonales y citometría de flujo, aunque incipientemente, está ofreciendo resultados satisfactorios en la detección de poblaciones T clonales. (www.citometriadeflujo.com)

   Además de la definición de línea celular y de la detección de restricción de cadena ligera en el linfocito B y restricción TCR en el linfocito T, la presencia de determinados patrones fenotípicos en un contexto biológico determinado (citología, citogenética y biología molecular) colabora a la clasificación de las diferentes neoplasias hematológicas: por ejemplo la expresión de CD5, CD23, y expresión débil o negativa de CD79b y cadenas ligeras en linfocitos B ciclina D1 negativos es característica de la LLC-B; la expresión de CD5, CD79b, con negatividad de CD23 o expresión heterogénea en linfocitos B generalmente con restricción de cadena ligera Lambda y ciclina D1+ es característica del linfoma de la zona del manto; la expresión de CD11c de alta intensidad, CD25, y CD103 en linfocitos B de mayor complejidad que los linfocitos B maduros normales de sangre periférica es típica de la tricoleucemia; la expresión de CD38 de alta intesidad con sobreexpresión de CD56 y negatividad de CD19 en células de tamaño y complejidad intermedio-alto es característico del mieloma múltiple; la expresión de CD8, CD56, CD57 y CD3 es característica de la leucemia de linfocitos grandes granulares de fenotipo T.(www.citometriadeflujo.com)

    El conocimiento de la hematopoyesis normal permite conocer la existencia de fenotipos leucémicos de gran utilidad para la detección de poblaciones neoplásicas a baja frecuencia, bien en el diagnóstico o el seguimiento de una neoplasia hematológica. Se definen tres patrones fenotícos aberrantes: A) Infidelidad de línea: presencia de un antígenos de una línea celular en una neoplasia de otra línea celular (por ejemplo expresión de antígenos mieloides en una leucemia aguda linfoblástica de línea B o T). (www.citometriadeflujo.com)