La anexina-V es una proteína que se une específicamente al fosfolípido: fosfatidilserina, el cual se encuentra en la cara interna de la membrana plasmática y es expuesto en la cara externa de dicha membrana cuando comienza el proceso de apoptosis. Para la unión de la proteína con el fosfolído es requerida la presencia de calcio, por lo que será necesario la preparación de un binding buffer donde se mantendrá la suspensión celular.
PREPARACION
DEL BUFFER
Binding Buffer(BB): diluir 1:10 binding Buffer en H2Od.
Lo vamos a necesitar en la dilución de la ANEXINA-V ,en la suspensión
celular y en diluir Ioduro de Propidio
Para 2
tubos de suspensión celular necesitaríamos 1mL de B.B por ej.
a) 100 ul de BB en 900 ml de H2Od.
Para la Anexina (2 tubos):
b) 1ul BB en 9ml de H2Od
Para el Ioduro de Propidio:
c) 100 ul BB en 900 ul de H2Od
Anexina-v:
Diluir 1:10 en B:B.diluído.
Tomar 1 ul de Anexina-v en 9 ul de B.B. diluido preparado en b)
Ioduro de Propidio:
250 ug IP en 1 mL de B.B. diluido preparado en c).
Tomaremos sólo 5 uL para cada tubo, el resto ya queda preparado para
próximos usos.
DETECCION
DE APOPTOSIS DE SUSPENSION CELULAR CON ANEXINA-V
1) Añadir 5 ml de RPMI o PBS (en frío) a la muestra.
2) Centrifugar a 300 g. durante 5 min.
3) Eliminar sobrenadante.
4) Resuspender el botón en binding Buffer (frío-hielo) a 1 x106
células/ mL manteniendo los tubos en hielo.
5) Añadir a 490 ul de suspensión celular preparada anteriormente
5ul de Anexina diluida FITC y 5ul de Ioduro de Propidio diluido.
6) Incubar durante 10 min en hielo y oscuridad.
7) Analizar la muestra por citometría de flujo.(www.citometriadeflujo.com)