En nuestro laboratorio nos centramos en la detección fundamentalmente de BCL-2, BAX, BCL-X y MCL-1.
La detección de Bcl-2 se realiza mediante la técnica estándar de detección de antígenos intracelulares anteriormente explicada.
En cuanto a la detección de BAX, BCL-X y MCL-1, seguirá un procedimiento algo diferente al de BCL-2 dado que los anticuerpos disponibles para estas proteínas son anticuerpos policlonales sin conjugar con ningún fluorocromo. Se trata por tanto de un marcaje de fluorescencia indirecta e intracitoplásmico con anticuerpos policlonales.

1) Añadir 1x10⁶ células a cada tubo.
2) Marcar los antígenos de membrana con los AcMo correspondientes.
3) Incubar durante 10-15 min. a Temperatura ambiente en oscuridad.
4) Añadir a todos los tubos (incluido el control) 100µl de Solución Fijadora A del kit INTRASTAIN de DAKO (Ref. K2311).
5) Incubar durante 15 min. en oscuridad y temperatura ambiente.
6) Añadir 5ml de PBS.
7) Centrifugar a 300g. durante 5min.
8) Decantar el sobrenadante.
9) Resuspender totalmente el pellet.
10) Añadir a todos los tubos (incluido el control) 100µl de Solución Permeabilizante B del kit INTRASTAIN de DAKO (Ref. K2311).
11) Añadir 10µl de cada uno de los anticuerpos policlonales intracitoplásmicos Bax, Bcl-X y Mcl-1 (anteriormente diluidos 1:20 en agua destilada). Al control no se le añade nada.
12) Incubar 30´ a Temperatura ambiente y oscuridad.
13) Añadir 5ml de PBS.
14) Centrifugar a 300g. durante 5min.
15) Decantar el sobrenadante.
16) Resuspender totalmente el pellet.
17) Añadir 10 µl de Swine (Ig anti-rabbit DAKO ref.F0054) conjugado con FITC (diluido anteriormente 1:100 en H2Od) en todos los tubos (incluido el control).
18) Incubar durante 30 min. a 4ºC en Oscuridad.
19) Añadir 5ml de PBS.
20) Centrifugar a 300g. durante 5min.
21) Decantar el sobrenadante.
22) Resuspender el pellet en unas gotas de PBS y leer en citómetro.

Si se tarda en adquirir la muestra, mantener los tubos a 4 grados.
(www.citometriadeflujo.com)