CALIBRACION
DE 3 COLORES CON LINFOCITOS PARA CITOMETROS DE BD
Montar
el siguiente panel para marcaje directo con lisado:
- Un tubo con sangre lisada simplemente.
- Un tubo con sangre marcada con CD4 FITC/CD8 PE sin nada en FL3.
- Un tubo con sangre marcada solamente con CD3 PerCP.
- Un tubo con sangre marcada con CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP. (www.citometriadeflujo.com)
1) Encender el citómetro
y el programa Cell Quest de BD con la plantilla de trabajo habitual y la actual
calibración.
2) Sacamos los detectores/amplificadores y las compensaciones.
3)
Bajamos todos los voltajes de los detectores de SSC, FL1, FL2 y FL3 a 150 y
el amplificador de ganancia de FSC a 1,00. Ponemos todas las compensaciones
a 0.
4)
Sobre un dot/plot SSC/FSC adquirimos el tubo que tiene las células únicamente
lisadas.
5) Con los detectores a la vista subimos el amplificador de ganancia de FSC
y el voltaje de SSC hasta que las poblaciones celulares queden en el dot/plot
como en la fig. Los linfocitos entre los canales 200 y 400.
6)
Hacemos una ventana en linfocitos y adquiriendo esta ventana comprobamos sobre
un histograma SSC que el pico de los linfocitos queda realmente entre los canales
200 y 400.
7)
Abrimos un histograma con FL1 y adquiriendo siempre la ventana de linfocitos
subimos el voltaje de FL 1 hasta conseguir un pico en el histograma entre los
canales 100 y 101.
8)
Abrimos un dot/plot FL 2/FL1. y repetimos el paso anterior con FL2 en histograma
observando que la población de linfocitos se sitúa entre entre 100
y 101 como su control interno de negatividad Fl 1 y FL 2.
Nuestra
mas sincero agradecimiento al Profesor Alberto Orfao, quien con su sabia paciencia,
me ilustró en estos conceptos tediosos en una tarde lluviosa de Salamanca.
Gracias.
Ahora
ya tenemos ajustados los voltajes mínimos para los fotomultiplicadores.
10) Cerramos los histogramas y los detectores amplificadores. Vamos a compensar.
11) Sacamos las compensaciones.
12) Adquirimos el tubo con CD4 FITC/CD8 PE/ sin nada en FL3.
9)
Repetimos los dos pasos anteriores para FL 3. Pero con dot/plot en FL2/FL3 para
comprobar el control negativo.
13)
Sobre un dot/plot FL1/FL2 vamos subiendo la compensación FL1-FL2 hasta colocar
los linfocitos CD8 en su lugar y FL2-FL1 para colocar los linfocitos CD4 en
su lugar, evitando las infracompensaciones y las sobrecompensaciones.
14)
Subir FL3-FL2 para quitar a FL3 lo que detecta de FL2 sobre un dot/plot FL3/FL2
15)
Adquirimos el tubo en el que no tenemos nada el FL1, nada en FL2 y tenemos
CD8 en FL3.
16) Subimos la compensación FL2-FL3 para quitar a FL2 lo que detecta de FL3.
17) Adquirimos el tubo
CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP para comprobar que todas las poblaciones se
colocan en su lugar.
18) Para guardar
esta calibración En el menu general de Cell Quest Clic sobre Cytometer
ir a Instrument Settings… y aquí clic sobre Save para identificar con
el nombre de la calibración.
