Las ciclinas son proteínas que regulan la transición entre las distintas fases del ciclo celular. Para ello se asocian con las kinasas dependientes de ciclinas formando un complejo cuya actividad reguladora es constituída por la ciclina.
Estas proteínas se encuentran en el núcleo celular, por lo que será de gran importancia permeabilizar correctamente la membrana nuclear.
La muestra utilizada debe estar anticoagulada con EDTA.
Esta técnica se divide en dos partes fundamentales: Fijación y Marcaje. En la fijación haremos especial incapié en el tipo de ciclina que se quiere detectar.
Para todas las ciclinas excepto las D, fijaremos con el alcohol: ETANOL.
En cuanto a las ciclinas D, diferenciaremos entre D1 y D2/D3, de manera que la D1 seguirá el procedimiento normal de fijación salvo en el alcohol, siendo en este caso: METANOL.
Las ciclinas D2 y D3 deberán ser fijadas previamente con PARAFORMALDEHIDO 1% previo a la fijación con alcohol ETANOL.
A continuación se especifican los materiales y el procedimiento de fijación y marcaje para la detección de ciclinas mediante citometría de flujo.

REACTIVOS
- Buffer de lavado mantenido a 4ºC, (PBS/0,1%NaN3/1% suero fetal bovino inactivado. pH 7,1-7,4).
- Etanol al 75% a -20ºC,
- Metanol puro a -20ºC
- Formaldehído al 1% (libre de metanol) en PBS,
- Triton X-100 al 0.25% en Buffer de Lavado a 4ºC,
- Solución de Ioduro de Propidio: 10 µg /mL PI en PBS a 4ºC.

PROCEDIMIENTO FIJACIÓN
1) En un primer momento necesitaremos 4x10⁶ células para empezar a trabajar.
2) Añadir 10 ml de PBS.
3) Centrifugar a 300 g durante 5 min.
4) Decantar el sobrenadante.
5) Resuspender el botón en 10 mL de Buffer de lavado.
6) Centrifugar a 300g durante 5 min.
7) Decantar el sobrenadante.

NOTA: Para las Ciclinas D2/D3 (excepto D1) las células deberán:

a) Ser fijadas en 5mL de Paraformaldehído libre de Metanol al 1% en
PBS durante 15' en hielo (o a 4ºC) previa a la fijación con Etanol.
b) Siguiendo la incubación con formaldehído, centrifugar a 300g 5 min. y aspirar sobrenadante.
c) Resuspender el botón en 10 mL de Buffer de lavado, centrifugar a 300g durante 10 min. y aspirar el Sobrenadante. Luego ir al paso # 8.

8) Mientras se agita con el vortex, añadir gota a gota 10 mL de Etanol frío.
(para D1 usar Metanol puro en frío).
9) Incubar a -20ºC mínimo 2 horas. Las células fijadas pueden mantenerse durante 30 días a -20ºC en 75% de Etanol.

MARCAJE
1) Eliminar el Etanol centrifugando a 300g durante 5 min.
2) Decantar el sobrenadante.
3) Resuspender el botón en 10 mL de Buffer de Lavado.
4) Centrifugar 300g durante 5 min.
5) Decantar el sobrenadante.
6) Resuspender el botón.
7) Añadir 5ml de Triton x-100 frío al 0.25% en Buffer de Lavado.
8) Agitar con el vortex.
9) Incubar durante 5 min. en hielo o a 4ºC.
10) Añadir 10mL de Buffer de lavado.
11) Centrifugar a 300 g. Durante 5 min.
12) Decantar el sobrenadante.
13) Resuspender el botón en Buffer de Lavado a una concentración final de 1x 10⁷ células/mL.
14) Alicuotar 1x10⁶ células en tubos de 12x 75mm para marcaje.
15) Añadir 20µl de Anticuerpo Anti-ciclina o Control isotípico en condiciones de dilución óptimas.
16) Incubar durante 30 min. a temperatura ambiente y oscuridad.
17) Añadir 2mL de Buffer de Lavado.
18) Centrifugar a 300 g. Durante 5 min.
19) Decantar el sobrenadante.
20) Si se usa controles isotípicos y Anticuerpos conjugados directamente, ir al paso #26.
21) Si se usa controles isotípicos no conjugados, añadir 20ml de FITC- conjugado con Ig de cabra anti-ratón. (goat anti-mouse).
22) Incubar durante 30 min. a temperatura ambiente y oscuridad.
23) Añadir 2ml de Buffer de Lavado.
24) Centrifugar a 300 g. Durante 5 min.
25) Decantar el sobrenadante.
26) Resuspender pellet celular en 0,5 mL de solución de Ioduro de Propidio para análisis simultáneo de DNA, ciclo celular y expresión de ciclinas.
27) Incubar las células a 4ºC en IP durante 20 min. previo al análisis por citometría de flujo.
28) Analizar células marcadas antes de 4h. Mantener las células a 4ºC en oscuridad hasta su análisis (www.citometriadeflujo.com)