TECNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA POR CITOMETRIA DE FLUJO
 Técnica usada para detectar Ag presentes en la superficie celular de la serie blanca por medio de AcMo marcados con un fluorocromo. Las células son primeramente marcadas con los Ac Mo conjugados con fluorocromos, posteriormente la serie roja es lisada.

PROCEDIMIENTO:
1) Poner en cada tubo un volumen de muestra que contenga 1x106células.
2) Poner el anticuerpo monoclonal (la cantidad dependerá de la casa comercial que lo sirva debido a la concentración y el fluorocromo utilizado).
3) Agitar e incubar durante 10-15 min a temperatura ambiente en oscuridad.
4) Añadir 2 ml de solución lisante comercial (dietilenglicol y formaldehido).
5) Agitar e incubar durante 5-7 min. a temperatura ambiente y en oscuridad.
6) Centrifugar a 300g. durante 5 minutos a temperatura ambiente.
7) Decantar el sobrenadante.
8) Resuspender el botón celular.
9) Añadir 5 ml de PBS.
10) Centrifugar a 300g. durante 5 minutos a temperatura ambiente.
11) Decantar el sobrenadante.
12) Resuspender el botón celular.
13) Añadir 0.5-1 ml de PBS o Isoton.
14) Leer en el citómetro.(www.citometriadeflujo.com)

Complejo Ag-Ac marcado con fluorocromo
Ac Mo conjugado con fluorocromo

SOLUCIONES LISANTES COMERCIALES
Existen en el mercados básicamente 2 soluciones para lisar hematíes en muestras que vayan a ser analizadas por citometría de flujo, una que necesita un lavado posterior y otra que no necesita este lavado.


SOLUCION LISANTE SIN LAVADO QUICKLYSIS (CYTOGNOS Ref. CYT-QL-1)
Solución para lisar hematíes que se usa después del marcaje de los leucocitos con AcMo. Permite el procesamiento sin tener que lavar las células después de añadir la solución lisante, evitando así la perdida de células que siempre se produce con los lavados.
PROCEDIMIENTO:
1) Tras añadir los Ac-Mo según la técnica de marcaje de superficie (directo e indirecto), añadir 2 ml del lisante.
2) Agitar los tubos.
3) Tapar el tubo con parafilm.
4) Incubar 10 min. a temperatura ambiente y oscuridad en posición horizontal.
5) Agitar varias veces durante la incubación.
6) Adquirir en el citómetro aumentando el umbral de FSC para así eliminar los restos de los hematíes lisados.

SOLUCION LISANTE CON LAVADO
Como reactivos estos lisantes están compuestos por Formaldehido y Dietilenglicol y necesitan que la muestra sea lavada tras la lisis.
PROCEDIMIENTO:
1) Tras añadir los AcMo según técnica de marcaje de superficie (directo e indirecto), añadir 2 ml de sol lisante.
2) Incubar durante 6-7 min a temperatura ambiente y oscuridad.
3) Centrifugar a 300 g durante 5 min.
4) Decantar el sobrenadante.
5) Resuspender el botón.
6) Añadir 5 ml de PBS.
7) Centrifugar a 300 g durante 5 min.
8) Decantar el sobrenadante.
9) Resuspender el botón en 0,5 ml de PBS.'
10) Leer en el citómetro.
(www.citometriadeflujo.com)