Al tratarse de un antígeno intracitoplásmico, la permeabilización de la membrana celular es necesaria antes de la incubación con el anticuerpo.
Procedimiento de marcaje en células en suspensión sin eritrocitos:
1) Ajustar
la densidad celular a aproximadamente 1x107 células/mL.
2)
Añadir gota a gota y mediante vortex constante, 2mL de paraformaldehído
al 1% en PBS a los 100µl de suspensión celular.
3) Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
4)
Añadir mediante goteo y bajo constante vortex, 1mL de Metanol 100%
almacenado a -20ºC .
5) Incubar durante 10 minutos a 2-4 grados.
6)
Centrifugar durante 5 min. a 300g.
7) Aspirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.
8)
Añadir 2mL de PBS.
9)
Repetir el paso 6 a 7.
10)
Mezclar la suspensión celular con 10 µl de AcMo anti p53 o control
isotípico
11) Incubar a 4 grados durante 30 min.
12)
Repetir el paso 6 a 7.
13)
Resuspender en un apropiado volumen de PBS conteniendo 0,5 %PBS.
14) Analizar mediante citometría de flujo. (www.citometriadeflujo.com)